概括

  CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在生物进化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，用来对抗入侵的病毒、噬菌体及外源DNA 。CRISP R/Cas9系统主要包括两个元件： Cas9核酸内切酶和向导RNA(gRNA)，在gRNA引导下，Cas9蛋白在目的基因处进行切割，形成DNA双链断裂。细胞的修复系统修复断裂的双链DNA时，在缺口处随机插入或者删除若干核苷酸，通常会导致移码突变，从而发生基因功能改变，这时CRISPR/Cas9系统完成靶基因的编辑工作。同时通过对Cas9蛋白的改造来实现内源性过表达（SAM）和干扰（KI）。

SAM：点突变型的dCAS9蛋白失去切结合DNA序列的能力，dCAS9和转录激活因子VP64融合,加上能与RNA结合的MS2蛋白结合sgRNA，可特异性识别并结合目标基因的启动子。MS2蛋白上连接p65和HSF1转录激活蛋白。通过多种转录激活蛋白的协同作用，形成转录激活复合物，能够强效激活内源性目的基因的转录。

KI：不同于RNAi沉默方法，CRISPRi dCas9-KRAB系统在DNA水平上提供可抑制基因的表达。这使得高度特异性抑制非编码RNA，miRNA，反义转录物和核定位的RNA成为可能。

CRISPRi dCas9 -KRAB sgRNA

不同于RNAi沉默方法，CRISPRi dCas9-KRAB系统在DNA水平上提供可抑制基因的表达。这使得高度特异性抑制非编码RNA，miRNA，反义转录物和核定位的RNA成为可能。

原理：当dCas9被sgRNA引导到靶基因的转录起始位点TSS（transcription start site）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。为了进一步提高转录抑制的效率，dCas9融合了一个基因抑制结构域，如KRAB结构域，这样的蛋白称之为dCas9-KRAB。

组成：一个完整的CRISPRi dCas9-KRAB慢病毒载体系统包含两个部分：

载体元件：

dCas9-KRAB表达载体：

plenti CRISPRi dCAS9-KRAB： EF1A-dCas9-SV40NLS-KRAB-P2A-blasticin-WPRE

gRNA表达载体：plenti CRISPRi sgRNA ：hU6-sgRNA-EF1A-Puro-WPRE

优势：不改变内源基因组背景，与CRISPR基因编辑、传统基因敲除技术不同，dCas9-KRAB CRISPRi系统不会改变靶基因位点基因组序列。 

抑制效果：使用dCas9-KRAB CRISPRi系统进行转录抑制，通常可以获得高水平的基因抑制效果。

适用的基因：该系统是在DNA水平抑制基因表达，适用于多种转录本基因，以及mRNA、非编码RNA、microRNA的转录制。

特异性：dCas9-KRAB CRISPRi系统可实现高效抑制同时，几乎没有脱靶现象。

不足之处：不同基因之间差异性，由于dCas9-KRAB需要接触到目的基因的调控序列，因此会因基因所处染色体位置不同，而产生不同的抑制程度。