外泌体（Exosomes）产生于细胞中的多泡体，是活细胞分泌的直径约为30~150 nm 的膜性囊泡，密度为 1.13-1.19 g/ml，有典型的“杯盘”形态。人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，近乎于平均每个人体细胞产生 1000-10000 个。通常 1ml 血液中存在 1×10^12 个外泌体。外泌体具有异质性，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA 以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控；在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发 展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
外泌体的分离方法主要有：差速离心、密度梯度离心、体积排阻色谱法、过滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法等。但是 CNS 上外泌体研究的文献中主流的分离方法目前还是超速离心的方法。超速离心分离可以准确地重复获取外泌体，同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化。
目前我司对于外泌体的鉴定方法主要有：透射电子显微镜（TEM）、粒径分析（NTA 或 NanoFCM）、蛋白指标检测（Western Blot 或 NanoFCM）。
一，外泌体染色（全程避光）
1，按说明书进行染料配制：1 μL PKH26 染料 + 9 μL Diulent C。
2，加入 PKH26 染料到外泌体（对照用 PBS）中，充分混匀，室温避光孵育 10min。
3，加入 1 mL PBS，Optima MAX-XP + 转子 TLA120.2，100000 g，离心17min，弃上清，无菌 PBS 重悬。
4，重复步骤 3，无菌 PBS 洗涤三次。
5，用 100 μL 无菌 PBS 重悬（避光保存），取 10 μL 提蛋白，进行蛋白浓度测定（BCA 法）。
6，染色后的外泌体与细胞共孵育
7，根据提出的蛋白浓度，计算出外泌体用量（25 μg/mL 培养基）。
8，细胞爬片，待细胞贴壁后，将染色后的外泌体加入细胞中，细胞培养箱共孵育 24 h。
二，核染和镜检
1，将细胞爬片取出，用 PBS 洗三遍。
2，加入 4% 多聚甲醛室温固定 30 min，用 PBS 洗三遍。
3，核染 10 min，封片。
4，共聚焦下镜检。
1，细胞生长情况
2，外泌体电镜图
3，外泌体示踪结果
3.1 BCA 测定外泌体蛋白浓度
标准曲线
将外泌体蛋白测出的 OD562 分别带入到以上公式进行计算，提取得到的外泌体蛋白浓度及总质量见下表：
样本名称 | 光密度 （OD562nm） | 蛋白浓度 （加裂解液，μg/μL） | 蛋白浓度 （原浓度，μg/μL） |
细胞(染色后) |
0.109 |
0.426 |
0.532 |
3.2 外泌体示踪结果：
