概括

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在生物进化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，用来对抗入侵的病毒、噬菌体及外源DNA 。CRISP R/Cas9系统主要包括两个元件： Cas9核酸内切酶和向导RNA(gRNA)，在gRNA引导下，Cas9蛋白在目的基因处进行切割，形成DNA双链断裂。细胞的修复系统修复断裂的双链DNA时，在缺口处随机插入或者删除若干核苷酸，通常会导致移码突变，从而发生基因功能改变，这时CRISPR/Cas9系统完成靶基因的编辑工作。同时通过对Cas9蛋白的改造来实现内源性过表达（SAM）和干扰（KI）。

SAM：点突变型的dCAS9蛋白失去切结合DNA序列的能力，dCAS9和转录激活因子VP64融合,加上能与RNA结合的MS2蛋白结合sgRNA，可特异性识别并结合目标基因的启动子。MS2蛋白上连接p65和HSF1转录激活蛋白。通过多种转录激活蛋白的协同作用，形成转录激活复合物，能够强效激活内源性目的基因的转录。

KI：不同于RNAi沉默方法，CRISPRi dCas9-KRAB系统在DNA水平上提供可抑制基因的表达。这使得高度特异性抑制非编码RNA，miRNA，反义转录物和核定位的RNA成为可能。

KO：通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA（DSB)；

移码突变

CRISPR/Cas9造成基因编辑的机制      

基因组DNA的两种修复途径:    NHEJ （Nonhomologous end joining）非同源末端连接

                    HR （homologous recombination） 同源重组

                    断链的位置在PAM区上游的2-3bp，哺乳细胞中DNA断链修复以NHEJ通路为主。

检测方式

T7E1酶切法检测突变体原理:  T7核酸内切酶I识别不完全配对DNA、异源双链DNA并切刻双链 DNA。

实验步骤 :

 1、针对突变位点(target site)DNA片段设计引物进行PCR扩增，突变位点不位于PCR片段中央（切割出两条大小不同的条带）。

 2、突变体DNA与野生型DNA的PCR产物按体系配制，混均后95 ℃加热5 min（热变性），后自然冷却至室温进行加、退火复性处理。