外泌体简介
外泌体（Exosomes）产生于细胞中的多泡体，是活细胞分泌的直径约为30~150 nm的膜性囊泡，密度为1.13-1.19 g/ml，有典型的“杯盘”形态。人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，近乎于平均每个人体细胞产生1000-10000个。通常1ml血液中存在1×10^12个外泌体。外泌体具有异质性，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控；在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
外泌体的分离方法主要有：差速离心、密度梯度离心、体积排阻色谱法、过滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法等。但是CNS上外泌体研究的文献中主流的分离方法目前还是超速离心的方法。超速离心分离可以准确地重复获取外泌体，同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化。
目前我司对于外泌体的鉴定方法主要有：透射电子显微镜（TEM）、粒径分析（NTA或NanoFCM）、蛋白指标检测（Western Blot或NanoFCM）。
外泌体超速离心抽提
1 在37 ℃中速融样本。
2 将样本移动至一个新的离心管内，2000 × g，4 ℃，30 min离心。
3 小心的将上清液移至新的离心管中，12,000 × g，4 ℃，45 min再次离心，以去除较大的囊泡。
4 取上清，经0.45 μm滤膜过滤，收集过滤液。
5 将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4 ℃，110,000 × g 离心70 min。
6 去除上清，用10 mL预冷的1×PBS重悬后，选择超速转子，再次4 ℃，110,000 ×g，超速离心70 min。
7 去除上清，用100 μL预冷的1×PBS重悬。
外泌体标志物鉴定
通过WB检测外泌体经典蛋白标志物（CD9/CD63/TSG101）用以鉴定是否分离到的产物是外泌体.
技术原理
通过对分离到的外泌体进行蛋白裂解后，WesternBlot进行CD9，CD63，TSG101的检测，鉴定蛋白产物是否来源于外泌体。
结果展示
外泌体进行蛋白裂解后，通过western blot检测外泌体蛋白标志物。
使用电镜来分析其大小和形态，来判断分离出来的是否是外分泌体以及纯度。
外泌体exosome是直径约为30-150 nm的小囊泡，天然存在于所有体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，且其蛋白、RNA和脂肪成分特异，通过透射电镜分析外泌体大小和形态。
通过电镜检测抽提到的外分泌体形态和大小来判断抽提到的是否为外分泌体。
1 将通过超速离心分离得到的外泌体取出5 μL稀释到30 μL，送样检测。
2 先用标准品进行仪器性能测试合格后方可进行外泌体样品上样，注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针。
3 待样本完成检测即可获得仪器检测外泌体的粒径和浓度信息。
结果展示
参考文献
1.Yang Het al., Exosome-Derived miR-130a Activates Angiogenesis in Gastric Cancer by Targeting C-MYB in Vascular Endo- thelial Cells,Mol Ther. 2018 Oct 3;26(10):2466-2475.
2.Dorayappan KDP. et al.“Hypoxia-induced exosomes contribute to a more aggressive and chemoresistant ovarian cancer phenotype: A novel mechanism linking STAT3/Rab proteins”Oncogene. 2018 Jul;37(28):3806-3821.
3.Brain metastatic cancer cells release microRNA-181c-containing extracellular vesicles capable ofdestructing blood–brain barrier.Nat Commun. 2015 Apr 1;6:6716.
4.Macrophages define dermal lymphatic vessel calibre during development by regulating lymphatic endothelial cell proliferation.
